Kemisk biologi

Fragmentbaserad läkemedelsutveckling är inriktat på design och utveckling av nya aktiva substanser. NMR spektroskopi fungerar här som ett viktigt verktyg för att med liganddetekterade experiment karakterisera icke-kovalenta protein – ligand komplex. I tillägg finns det en bred repertoar av proteindetekterade experiment som kan presentera högupplösta data vad gäller bindingssäte och bindningskarakteristik för protein – ligand komplex med hög såväl som låg affinitet.

Fragmentbaserade screens (FBS) med NMR möjliggör samtidig testning av ett stort antal lågmolekylära (< ca 500 Da) molekyler mot ett specifikt målprotein eller annat molekylärt komplex. Svenskt NMR centrum är utrustat med högfältsmagneter (600-800 MHz) med kallprober optimerade för ¹H eller ¹⁹F detektion, automatiska provväxlare och den robotteknik som behövs för att med hög precision förbereda det antal prover som behövs i en FBS screen. Detta möjliggör detektion av specifika protein – ligand interaktioner för upp till 1000 fragment inom loppet av några dagar.

Liganddetekterad FBS

Fragment- eller liganddetekterade strategier är förstavalet givet ett definierad målprotein. Experimenten syftar till att mäta förändringar i spektra av ligander i närvaro av en protein – ligandinteraktion. Antalet ligander är inte begränsat, men som oftast används 10-1000-talet ligander antingen samlade i så kallade fragmentbibliotek eller som individuella prover av t.ex. naturprodukter, peptider eller läkemedelskandidater. Svenskt NMR centrum tillhandahåller två huvudsakliga bibliotek: ’Maybridge Ro3 diversity fragment library core set’ innehållande 800 fragment och ’Bionet ¹⁹F fragment library’ inköpt från Key Organics innehållande 428 fragment. Fragmenten i båda dessa bibliotek är framtagna givet ’rule of 3’ där molekylvikt, lipofilitet och möjligheten till intermolekylära vätebindningar begränsats, i tillägg till avsaknad av reaktiva grupper och PAINS. Vi erbjuder också möjligheten att utföra screener där användaren själv bidrar med valfritt fragmentbibliotek eller set av molekyler.

En FBS inleds med kvalitetskontroll av de ingående substanserna. Varje individuellt fragment löses först främst i DMSO-d₆ på vilket det spädes med lämplig buffert. Ett påföljande proton- eller annat relevant spektrum används för att verifiera fragmentets löslighet, renhet och integritet under de givna förutsättningarna. De upptagna spektra kan sedan användas som referensmaterial i flertalet påföljande screeningar. Fragmenten blandas med varandra i grupper om tio eller fler och adderas till ett prov av proteinet i 10-faldigt eller högre överskott. Detta bidrar till att en låg mängd protein kan användas i jämförelse med proteindetekterade experiments (se nedan), men också att proteinet ej behöver isotopinmärkas. Liganddetekterade experiment har också den fördelen att linjebredden i spektra inte begränsas av proteinets storlek och dessa experiment kan således utan kompromisser användas för proteinprover med mycket hög molekylvikt. De NMR experiment som körs är en kombination av eller individuella uppsättningar av antingen water-ligand observed via gradient spectroscopy (Water-LOGSY), saturation transfer difference (STD) alternativt T2 eller T1,rho relaxationsexperiment. ¹⁹F-detekterade experiment har blivit allt mer populärt som ett komplement till ¹H-detektion, främst p.g.a. det större spannet av kemiska skift för ¹⁹F jämfört med ¹H, samt de mycket förenklade spektra avseende antalet toppar och kopplingsmönster. Detta reducerar drastiskt risken för överlapp i spektra där fragment kombinerats och möjliggör således blandningar med betydligt fler är 10-talet fragment. Högre ¹⁹F CSA leder också till en större kemisk skiftskillnad mellan liganden i fritt och bundet tillstånd och därför ett större svar i T2-filtrerade experiment. Sammantaget leder detta till att en mindre mängd protein behövs för ¹⁹F-detekterade FBS försök jämfört med ¹H-detekterade.

En kombination av de olika FBS experimenten är att rekommendera, samt att validering av resultatet sker för varje individuellt fragment. När det är möjligt bör experiment också köras i närvaro av en inhibitor eller molekyl med känd interaktionsstyrka och bindningsställe. Svenskt NMR centrum använder 'Bruker FBS tool' för att storskaligt och systematiskt analysera data. Resultaten kan sedan användas för att bygga på, länka ihop eller på annat sätt modifiera de omfattade fragmenten för att i förlängningen hitta molekyler med högre affinitet för målproteinet. Dessa komplex kan med fördel vidare studeras med proteindetekterade NMR metoder.

Proteindetekterade NMR experiment, en utgångspunkt

De protein – ligand komplex som identifierats genom liganddetekterade FBS eller på annat sätt kan studeras i detalj med proteindetekterade NMR experiment, vilka kan ge detaljerad information om interaktionens kinetik, affinitet och bindningsställets placering. Sådana mätningar utgår ofta från titrerserier där kemiska skiftförändringar hos proteinet observeras med hjälp av ¹⁵N/¹³C, ¹H-HSQC, HMQC eller TROSY experiment. För att uppnå tillräcklig känslighet krävs det inte sällan att proteinet helt eller selektivt isotopmärks och resultatet beror starkt av interaktionens grundläggande egenskaper så som affinitet och kinetiska variabler, men även av proteinets molekylvikt och stabilitet. Tillsammans med full eller delvis tillordning av proteinets kemiska skift eller till och med tillgänglig struktur eller dynamiska data så kan de uppmätta kemiska skiftförändringarna noggrant precisera bindningsstället på atomär nivå. Samstämmiga uppgifter från t.ex. flertalet bindare eller kristallografidata kan i kombination med mer avancerade strukturbiologiska NMR experiment vara mycket användbara för att ytterligare karakterisera protein – ligand interaktionen.

Tillbaka till toppen