Metabolomik
Svenskt NMR Centrum är genom SwedNMR och SciLifeLab en nationell anläggning för NMR-baserad metabolomik.
Metabolomik - vad är det?
Metabolomik är en approach inom livsvetenskaperna som fokuserar på analys av små (<1.5 kDa) molekyler, metaboliter, i deras koncentrationsvariation med tiden och i olika system som respons på interna eller externa stimuli. Dvs, metabolomik är identifiering och kvantifiering av metaboliter i ett biologiskt prov vid ett givet tillfälle och förhållande. Metabolomik är således ett mått på den biokemiska fenotypen vid ett givet tillfälle, en '-omics'-teknik som beskriver snabbare biologiska förändringar än exempelvis genomik och proteomik.
De två förhärskande teknikerna inom metabolomik är masspektrometri och NMR. Den förstnämnda tekniken är tillgänglig för forskare i Sverige främst genom Swedish Metabolomics Centre, som också har en nod i Göteborg i och med Chalmers Mass Spectrometry Infrastructure. Svenskt NMR Centrum i Göteborg och i Umeå erbjuder NMR-baserad metabolomik, med både tillgång på expertis inom datainsamling av prover i fast fas (ex. biopsier) och för biovätskor, men även support för statistisk analys av insamlad data.
För NMR innefattar ett typiskt metabolomikprov detektion och kvantifiering av 50 till några hundra metaboliter beroende på vilken provmatris det handlar om. På svenskt NMR Centrum har vi erfarenhet av en bred palett av matriser. Majoriteten är av humant ursprung (serum, plasma, urine, fekalievatten, extrakt av olika vävnader såsom muskler, lever och hjärna) men vi har även erfarenhet av prover från mus, råtta, jäst, nematoder, insekter, makroalger, kiselalger, mammaliecellkulturer och bakterier.
Länkar till andra infrastrukturer
I metabolomik är den preanalytiska fasen, planering, insamling av prover och provberedning, mycket viktig för att undvika förväxlingsfaktorer i spektra. Små praktiska överväganden som bör göras är bland annat:
- Finns det en SOP (Standard operating procedure) för provtagning som tex beskriver provtagningsrör, tid fram till centrifugering, centrifugeringshastighet, lagringstemperatur, hur prov kan transporteras, som bör användas?
- Om provtagningen sker på olika platser, av olika personer, har man försökt göra en enhetlig SOP?
Ett centralt mantra i planeringen av ett metabolomikprojekt är ”samma, samma, samma”, för att säkerställa att även vid en kanske suboptimal provtagning och provberedning kommer jämförelser mellan spektra vara meningsfull.
Fallstudie
Studien handlar om effekten av gastrisk bypass-kirurgi och medicinering vid diabetisk njursjukdom (DKD). Urinprover blandades enligt Brukers IVDr SOP för mänskligt urin, dvs 9:1 prov:buffer innan överflyttning till SampleJet NMR tub-rack. Provberedningen gjordes med en Bruker SamplePro liquid handling robot (smeknamn "Sebulba") för att minimera mänskliga hanteringsfel. Alla proverna hölls kalla under hela provberedningsprocessen och också i provväxlaren innan mätning i spektrometern. Mätordningen randomiserades för att minimera batcheffekter.
Publikation fallstudie
Nyligen publicerade SNC-understödda metabolomikartiklar
- Kelpsiene et al. 2023 Environmental Science: Nano (Extern länk)
- Hasselbalch et al. 2023 Metabolomics (Extern länk)
- Nilsson et al. 2022 Frontiers in Neuroscience (Extern länk)
- Martin et al. 2022 Clinical Sciences (Extern länk)
- Martin et al. 2022 Metabolites (Extern länk)
- Martin et al. 2022 Frontiers in Endocrinology (Extern länk)
- Klinke et al. 2022 Cellular and Molecular Life Sciences (Extern länk)
- Veskovski et al. 2021 Experimental Hematology (Extern länk)
Vanliga frågor: preanalytisk fas
2. NMR-datainsamling
Datainsamlingen använder i hög grad automatisering, från provhantering till mätning i spektrometern, för att kunna köra 24/7 utan mänsklig inblandning. På SNC finns spektrometrar för metabolomik utrustade med kylda SampleJets som kan hantera upp till 480 NMR prover per SampleJet. I praktiken görs provberedning och isättning av prover i SampleJet i en takt som motsvarar spektrometerns tempo i datainsamling.
För de allra flesta prover mäts 1-dimensionella 1H-NMR experiment på varje prov. Typiskt innebär det experimenten 1D-NOESY (metaboliter och proteiner/högmolekylära komplex), 1D-CPMG (bara metaboliter), och 1D diffusion (bara högmolekylära komplex).
Vanliga frågor: datainsamling
3. Processning av NMR-data
Data Fourier-transformeras från tids- till frekvensdomän följt av fasning och baslinjeskorrigering. I spektra har de olika metaboliterna karakteristiska toppmönster samt intensiteter proportionella med koncentration, vilket i teorin gör både annoteringar och koncentrationskvantifiering enkel. Ofta överlappar dock toppar från olika metaboliter, vilket i kombination med små förändringar i toppositionen mellan spektra på grund av varierande pH och jonstyrka försvårar identifiering och koncentrationsbestämning. För att komma åt den problematiken krävs antingen dekonvolering för att separera signalerna från olika metaboliter eller en mindre ambitiös metod som delar upp spektra i "buckets" där man får acceptera att vissa mätvärden är summor av koncentrationer från olika metaboliter.
Manuell dekonvolering av spektra
Ett exempel på manuell dekonvolering och identifiering av metaboliter i ett serumprov med hjälp av programvara och referensdatabaser över spektra. Överlappande signaler kan vara ett betydande problem, till exempel överlappar de tre signalgrupperna för glycerol (i grönt) med glukos och andra metabolitsignaler.
Automatisk dekonvolering av spektra
Ett exempel på automatiserad dekonvolering med hjälp av TopSpin-funktionen mldcon (Bruker BioSpin), applicerat på spektrumet av ett likvorprov.
4. Dataanalys och metabolitidentifiering
Vanligtvis bedöms först den övergripande kvaliteten och de allmänna trenderna i data, ofta med hjälp av principalkomponentanalys (PCA).
Fallstudie: huvudkomponentanalys
Redan från en PCA (A, B) score plot framgår det tydligt att medicinsk behandling ensamt (MTA) och i kombination med gastrisk bypass plus medicinsk behandling (CSM) efter sex månader skiljer sig från varandra och från baslinjen. (C) Från de motsvarande loadings kan några molekyler som är viktiga för separationen identifieras.
Därefter bedöms eventuella samband mellan data och oberoende variabler med t ex Orthogonal Projections to Latent Structures (OPLS) eller Random Forrest.
Fallstudie: supervised modelling
En PLS-modell av baslinje kontra CSM sexmånadersprover visar övertygande att det finns skillnad mellan grupperna (A, B, D). (C) Genom att använda ett antal variabler motsvarande mellan ”minimal-optimal” och ”alla relevanta” variabler uppnås bästa separation med optimal valideringsprestanda. (E) De viktigaste variablerna (metaboliterna) för modellen och om de har högre eller lägre koncentrationer sex månader efter operationen.
Sedan analyseras data med traditionell univariat analys för att söka efter individuella metabolitassociationer till oberoende variabler.
Fallstudie:
(A-D) Univariata jämförelser mellan baslinje och MTA samt CSM efter sex månader. (C) Univariat analys ger ofta liknande resultat som multivariat analys.
Vanliga frågor: dataanalys och metabolitidentifiering
5. Biologisk tolkning
Den biologiska tolkningen av mätningarna lämnas vanligtvis till kunden, men SNC är glada att kunna hänvisa till relevant bioinformatisk kompetens vid NBIS.
Fallstudie
NMR-baserad urinmetabolomik visar gastric bypass kirurgi-inducerade förändringar i samverkan mellan värd och mikrobiotametabolism, metabolism av aromatiska aminosyror och nedbrytning av grenade aminosyror (BCAA) som del i positiva förändringar på blodtryck, glycemi, albuminuri i patienter med obesitas, typ 2-diabetes och tidig kronisk njursjukdom under medicinsk behandling.
Instrumentering för metabolomik
Instrumenteringen på NMR centrum i Göteborg innefattar fullt automatiserade kylda provväxlare kopplade till 800 MHz och 600 MHz spektrometrar. 600 MHz systemet är uppsatt som ett Bruker IVDr instrument (Länk till information hos Bruker) vilket gör att data genererade på SNC i Göteborg är direkt jämförbara med resultat från andra faciliteter runt om i världen. Detta möjliggör samarbeten med stora provserier såväl som longitudinella studier där prover mäts vid olika tidpunkter då datainsamlingen är direkt reproducerbart över överskådlig tid.
Provberedning och provhantering är fullt automatiserad och följs med hjälp av ett streckkodssystem. Provflödet är 45-70 per dygn på endera 600 eller 800 MHz-systemen.
När man kör plasma/serum under IVDr SOP så analyseras varje prov, förutom metabolit och lipoproteinprofilering, även ur kvalitetsaspekter, både ur provkvalitet som spektral kvalitetssynpunkt. Förutom en kontroll av att NMR-spektrokopin utförs enligt IVDr-specifikationer så bedöms provets identitet och integritet. Preanalytisk felhantering av provet eller kontaminering vid provtagningstillfället kan detekteras och är i sin tur något som kan och bör has i åtanke vid analys av metabolit och lipoproteindata.
Kontakta oss gärna om ni vill veta mer om NMR, om vad som är möjligt, hur man hanterar provtagning (blod, serum, urin osv.) för bästa möjliga NMR resultat.
